２００１年３月 臨床免疫に執筆した文章を一部改変 （高浜洋介；図はリクエストに応じてお送りします）
Ｔ細胞とＢ細胞への分化方向を決定する分子要因
はじめに
私達のからだを外来微生物から防御するために中心的な役割を果たすリンパ球は、抗体を産生するＢリンパ球と、抗体産生の司令制御や感染細胞の排除に携わるＴリンパ球に２分され、これらのリンパ球はいずれも造血幹細胞より分化する。しかし、多能性の前駆細胞がどのようにして、かたや胸腺でＴリンパ球へ、かたや骨髄でＢリンパ球へと袂を分かっていくのかよくわかっていない。リンパ球分化でみられる細胞系譜分岐機構の理解を進めることは、高等生物における分化方向決定に共通の分子機構を解明するうえで格好のモデルを提供するばかりでなく、免疫不全症の病態理解や治療指針を確立していくために必須である。ここでは、Ｔ・Ｂリンパ球への分化系譜を決定する分子要因に関して最近の知見を中心に概説する。
リンパ球前駆細胞
造血幹細胞の分化系譜決定機構の研究は、しばしば顆粒球や単球などミエロイド系細胞への分化を対象とする解析が主流であった。幹細胞が濃縮された細胞分画を、メチルセルロースなどを含む液体培地のなかで培養すると、いくつかのコロニー刺激因子を添加することによって、１個の前駆細胞から複数の細胞系譜への分化を同時に観察することが比較的容易にできたのが、ミエロイド系細胞を対象とした研究が進んできた大きな要因といえる。一方、造血幹細胞のリンパ球系細胞への分化機構については、特にＢリンパ球分化を対象に多くの解析がなされていたものの、Ｔリンパ球への分化のみが胸腺という新たな臓器の存在を要求するということが、Ｔ・Ｂリンパ球への分化を同時に解析することに技術的な困難をもたらし、とりわけＴ・Ｂリンパ球の共通前駆細胞の有無や性状解析、あるいはＴ・Ｂリンパ球の系譜決定機構については、あまり明解な知見が得られてこなかった。しかしそのなかで最近、従来の解析技術の問題点を解決しつつ進められた、リンパ球共通前駆細胞に関するWeissmanらの研究とKatsuraらの研究の成果はとりわけ注目に値する。
WeissmanのグループにてKondoらは、骨髄細胞を分画し、放射線照射マウスへと移入してＴ・Ｂリンパ球をはじめミエロイド系細胞への分化能を丹念に調べることによって、骨髄細胞中のLin-IL7-R+Thy-1- Sca1low c-kitlowの分画には、Ｔ・Ｂリンパ球およびリンパ球系のＮＫ細胞への分化能はあるものの、マクロファージをはじめミエロイド系列への分化能がないことを示した。また彼らは、１個のLin-IL7-R+Thy-1- Sca1low c-kitlow骨髄細胞を試験管内で分裂させ、得られた細胞集団の一部をＢリンパ球への分化誘導培養に、残りの一部をＴリンパ球への生体胸腺内分化能の測定へと供することによって、ミエロイド系細胞への分化能を持たないＴ・Ｂリンパ球共通の前駆細胞（Common lymphoid progenitor; CLP）の存在を報告した(1)。
一方、KatsuraのグループにてKawamotoらは、デオキシグアノシン処理したマウス胎仔胸腺器官に、胎仔マウス肝臓から分画した１個の前駆細胞を導入し、stem cell factor、IL-3、そしてIL-7の存在下で器官培養することによって、Ｔ・Ｂ・マクロファージへの分化能を試験管内で同時に測定評価できる培養法を開発した(2)。Multilineage progenitor (MLP)アッセイと名付けられたこの方法を用いて彼らは、Lin-IL7-R+CD45+Sca1+c-kit+の胎仔肝臓細胞中には、Ｔリンパ球とＢリンパ球とマクロファージの３者へと分化能を持つ細胞、Ｔリンパ球とマクロファージの２者へと分化能を持つ細胞、Ｂリンパ球とマクロファージの２者へと分化能を持つ細胞、そしてＴリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージのいずれか１つのみへと分化能を持つ細胞が存在し、もっとも注目すべきことにＴリンパ球とＢリンパ球の２者のみへと分化能を示す細胞がみつからないことを示した(2,3)。この結果は、リンパ球前駆細胞の分化系譜決定においては、Ｔリンパ球とＢリンパ球の分岐のほうがリンパ球とマクロファージとの分岐よりも初期に起こることを示し、リンパ球系とミエロイド系の分岐がさきに起こり、その後Ｔ・Ｂリンパ球の分岐が起こるとするWeissmanらの見解と一致しなかった。
これら２つのグループの結論は一見相反するが、Weissmanらの実験では成熟マウスの骨髄から前駆細胞を精製しているのに対して、Katsuraらは胎仔マウスの肝臓から前駆細胞を精製している。これら精製臓器の差異は、２つのグループによるＴ・Ｂ共通前駆細胞のマクロファージ分化能の差異を説明するかもしれない。また、Katsuraらのグループの実験系は常にサイトカインの飽和供給状態での細胞分化測定であるため、もしもWeissmanらが後に主張したようにサイトカインによる分化系譜決定の変更が起きるのであれば(4)、Ｔ・Ｂ共通前駆細胞のマクロファージへの分化能変更を併せて観察している可能性も考えられよう。いずれにせよこれらの研究成果から明らかなように、Ｔ・Ｂリンパ球に共通した前駆細胞の存在が明らかになり、現在その性状解析が進められている。
Ｔリンパ球とＢリンパ球への分化を支配する核内因子群
それでは、Ｔ・Ｂ共通前駆細胞はどのようにＴリンパ球とＢリンパ球それぞれへと分化していくのだろうか？リンパ球分化の始動と方向性を支配する分子機構に関しては、ノックアウトマウスを用いた解析の成果が大きく寄与している。たとえば、zinc fingerタイプのＤＮＡ結合タンパクIkarosの欠損マウスではＴリンパ球とＢリンパ球が完全に消失する。Ｔリンパ球の分化は前駆細胞の胸腺への移住以前に影響を受けて停止してしまうし、Ｂリンパ球の分化も骨髄中のCD43+プロＢ細胞期の激減を伴って初期で停止してしまう。一方、Ikaros欠損マウスでは、ミエロイド系の血液細胞をはじめ、リンパ球以外の細胞には大きな分化異常は見られていない(5)。これらの結果から、IkarosはＴ・Ｂリンパ球に共通し、かつリンパ球に特化された分化始動因子のひとつと考えられる。
Ｔリンパ球とＢリンパ球の完全な消失は、ほかにもRAG-1欠損マウスやRAG-2欠損マウスなどで観察される。しかしこれらの分子は、リンパ球に固有の抗原レセプターのV(D)J組換えを惹起し、抗原レセプターの発現に必須である。それゆえ、RAG-1あるいはRAG-2欠損マウスでのリンパ球初期分化停止は、Ｔ細胞抗原レセプター構成成分（ＴＣＲβ鎖やＣＤ３ε鎖など）やＢ細胞抗原レセプター構成成分（μ鎖やＩｇα鎖など）の欠損マウスでＴリンパ球とＢリンパ球のそれぞれが比較的初期に分化停止することと合致する。これら抗原レセプター関連分子群は、リンパ球の機能実行分子としてリンパ球分化に重要であることは疑う余地のないものの、Ｔ・Ｂリンパ球への分化始動を支配する分子とは考えにくい。
Ｂリンパ球への分化には関与せずＴリンパ球への分化に関与する転写因子としてはGATA-3やTCF-1などが報告されている。Zinc fingerタイプの転写因子GATA-3は、Ｔリンパ球ばかりでなく腎臓や神経細胞などでの発現が認められており、GATA-3欠損マウスは胎齢１２日目で死亡する。しかし、RAG-2欠損ＥＳ細胞とGATA-3欠損ＥＳ細胞を混合して得られるマウスを用いた相補能解析から、GATA-3欠損細胞はＢリンパ球やミエロイド系血球細胞に分化できるのにかかわらず、きわめて初期の幼若胸腺細胞を含めてＴリンパ球への分化能を全く示さなかった(6)。これらの結果から、GATA-3はＴリンパ球に特化した細胞分化を支配する転写因子であると考えられる。
HMGボックスファミリーのＤＮＡ結合タンパクTCF-1およびその近縁分子LEF-1は、いずれも胎生期には多くの組織に発現が認められるものの、生後はリンパ球のみに発現される。TCF-1欠損マウスはこれまで２種類作成されていて、興味深い差異が示されているが、いずれもＴリンパ球の胸腺内成熟過程の中途で分化停滞が観察されている(7,8)。このことは、TCF-1はＴリンパ球の分化成熟には必須であるものの、前駆細胞がＴリンパ球へと方向決定する過程には関与しないことを示唆する。LEF-1欠損マウスでは生後種々の臓器に不全がみられるが胎生期のリンパ球分化は正常である9)。胎齢期のＴリンパ球分化はTCF-1/LEF-1ダブル欠損マウスのほうがTCF-1欠損マウスよりも初期に停止するが(10)、この場合においても、前駆細胞がＴリンパ球へと方向決定する過程にはTCF-1もLEF-1も必須の関与をするわけではないことが示唆される。
一方、Ｔリンパ球への分化に関与せずＢリンパ球への分化に関与する転写因子としては、E2A遺伝子産物群やPax-5遺伝子産物などの関与が報告されている。E2A遺伝子は、basic-helix-loop-helix (bHLH)タイプの転写因子E12, E47, ITF-1をコードする。E2A遺伝子産物群は多くの組織に発現される転写因子であるが、E2A欠損マウスではプロＢ細胞期でのＢリンパ球初期分化停止がもっとも顕著な形質であり、Ｔリンパ球分化への影響はみられない(11,12)。Paired box領域を有する転写因子BSAPをコードするPax-5遺伝子の欠損変異マウスにおいても、プロＢ細胞期以降のＢリンパ球初期分化が停止しており、Ｔリンパ球など他の血球細胞の異常はみられない(13)。これらの結果から、多能性の前駆細胞がＢリンパ球へと分化方向を決定する過程で、E2AやPax-5の遺伝子産物が関与することが示唆された。
このときおもしろいことに、Pax-5欠損マウスからIL-7存在下で増殖させたプロＢ細胞は、マクロファージや顆粒球などのミエロイド系血球細胞ばかりでなく、ＮＫ細胞やＴリンパ球への分化能を示し、多能性を保持していることが示された(14,15)。これらの結果から、Pax-5欠損プロＢ細胞の造血分化研究への有用性が示されたばかりでなく、Pax-5転写因子が多能性前駆細胞の多能性を抑制することによってＢリンパ球系譜への決定を支配する転写因子であることが示唆された。
細胞間シグナル伝達分子
それでは、これらリンパ球分化方向を支配する核内因子の活性化は、どのような細胞間シグナルによって発動され伝達制御されるのだろうか。このことについては未だよくわかっていないが、最近Notch-1とOncostatin Mに関して興味深い知見が得られているので紹介する。
Notch-1は、無脊椎動物から脊椎動物まで共通して種々の細胞の分化方向決定に関与し、Deltaファミリーのリガンドとの相互作用によって細胞内へとシグナルを発動する細胞表面分子である。ヒトやマウスなど哺乳類では４種類のNotchファミリー分子がある。そのうち、Notch-1が免疫・血液細胞の分化調節に関わることは、まずＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞の分化系譜決定にNotch-1の過剰発現が影響することから示唆された。一方、Notch-1の欠損マウスは胎齢１０日頃までに致死であったが、Cre/loxPを用いた後天的欠失誘導マウスを用いるによって、Notch-1欠損によって胸腺でのＴリンパ球分化が初期で停滞し、かわりに胸腺でのＢリンパ球の異所性分化が促進されることが示された(16)。逆に、幼若造血細胞に活性化型Notch-1を過剰発現させると、Ｂリンパ球分化の初期停滞と骨髄での異所性Ｔリンパ球分化が認められた(17)。これらの結果からNotch-1は、Ｔリンパ球とＢリンパ球の分化方向決定に関与する分子であることが示唆された。
また、Oncostatin M過剰発現トランスジェニックマウスやOncostatin M投与マウスにて、胸腺非依存性にリンパ節でのＴリンパ球の成熟が誘導されることが報告されている(18,19)。これらの生理的意義には不明なことも多いが、胸腺という組織全体ではなく、Ｔリンパ球への分化を支配する１個の分子としてOncostatin Mが機能しうる可能性を示唆して興味深い。
おわりに：新たなマウスモデル
以上、共通の前駆細胞からＴリンパ球とＢリンパ球がどのように分化するのか、最近の知見をまとめた。Pax-5に関する多能性抑制による分化系譜決定など、比較的理解の進んできたことがらもあるが、全体像の理解にはまだまだ遠いと思われる。
ところで私達は最近、Ｔリンパ球分化の分子機構の解析を進めてきたなかで、ヒトＣＤ３εトランスジェニックマウスの１系統ｔｇε２６では胸腺に移住した前駆細胞はＴリンパ球へと分化せず、そのかわりにＢリンパ球へと成熟してしまい、その結果、Ｔリンパ球特異的免疫不全を発症することを発見した(20)。この異常は、同じコンストラクトで作製された他のトランスジェニックマウス系統では見られず、導入されたトランスジーンもとりわけ他の系統に較べて特記すべきコピー数ではなかったことなどから、トランスジーン挿入による系統特異的ゲノム異常によると考えられた。これまでに、fluorescence in situ hybridization法によってトランスジーンは染色体ゲノムの１カ所に挿入されていることがわかったので、現在、トランスジーン挿入ゲノムのクローニングと遺伝子機能の解析を進めつつ、Ｔ・Ｂリンパ球の分化系譜決定に関与する遺伝子の同定を目指している。
このとき興味深いことに、Ｔリンパ球への分化が停止しＢリンパ球への分化が見られるｔｇε２６マウスの胸腺細胞において、Ｔ細胞特異的転写因子のうちGATA-3とTCF-1の発現が認められ、一方、PEBP-2αA, PEBP-2αB, LEF-1の発現は認められなかった。GATA-3とTCF-1の発現はｔｇε２６胸腺細胞から精製された成熟Ｂリンパ球からも認められた。これらの結果から、GATA-3とTCF-1の発現は胸腺内前駆細胞がＴリンパ球へ分化方向を決定するのに十分ではないことが示唆された(20)。
私たちは今後更に、この変異マウスを用いた分化系譜決定の異常をもたらす分子機構を明らかにすることによって、Ｔ・Ｂリンパ球の分化方向決定機構のよりよき理解に貢献したい。
参考文献
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